체다치즈의 콜레스테롤과 유리 아미노산 측정과정

- Cholesterol 정량분석

ⅰ) GC정량을 위한 시료

추출액을 둥근 플라스크에 넣고 40℃에서 감압 농축기로 농축시킨 후 1㎖ hexane에 녹여 microtube에 보관하였다(51). Cheddar cheese 1g을 screw cap tube에 넣고 1㎖ 내부표준물질(5α-cholestane 1㎎/㎖ 99.8% ethanol)과 5㎖ 2M ethanolic potassiumhydroxide용액을 첨가(11)한 후 잘 혼합하였다.그리고 5㎖ hexane과 5㎖의 distilled water을 첨가하여 cholesterol을 추출 하였으며 이를 4회 반복하였다. 65℃에서 30분동안 항온수조에 검화(50) 한 후 실온에서 냉각시켰다. 

 

ⅱ) GC에 의한 정량 방법

Carrier gas로 N2를2㎖/min 사용하였으며, air는 300㎖/min, H2는 30㎖/min 그리고 auxiliary gas는 N2를 28㎖/min 주입하였다. 시료의 split ratio는 1 : 50으로 조절하였으며 모든 기체의 유량은 35℃에서 측정하였으며, 주입구의 온도는 270℃, 검출기의 온도는 300℃로 설정하였다. 분리한 추출액 1㎕를 다음의 조건에서 GC에 injection 하여 cholesterol의 정량분석을 실시하였다. 칼럼은 최초 200℃에서 1분간 머무른 후 분당 10℃씩 상승시켜 300℃로 올린 후 20분간 유지하였다. Cholesterol과 cholestane은 머무름 시간에 따라서 구분되며, 각각의 피크면적에 의해 정량분석하였다. 분석에 사용된 GC는 Hewlett-Packard Model 5890 Series Ⅱ (Hewlett-Packard CO., Palo Alto, Ca, USA)로서 split injector와 FID(flame ionized detector)가 장착되어 있으며, column은 30m × 0.32mm I.D. ×0.25 ㎛ file thickness 인 cross-linked 5% phenyl methyl silicone fused silica capillary(HP-5)을 사용하였다.

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- Short-chain free fatty acids (SFFAs)

SFFAs 를 정량 분석하기 위하여 Deeth 등(52)의 방법을 사용하였으며, 이때 GC조건은 Table 1 과 같다. 정량분석을 상세히 설명하면 다음과 같다. 불활성 alumina 19.2g을 증류수 0.8ml에 넣고 유리막대로 저어 2시간 방치한다. 치즈 1g을 test tube에 넣고 ethly ether 5ml, 4N H2SO4 0.1ml, sodium sulfate 2.5g을 차례로 넣어 vortex mixing 후 2시간 방치하였다. 이 용액에 hexane 5ml을 혼합하여 vortex mixer하여 200 x g 에서 5분간 원심분리하였다. Small glass chromatography column에 glass wool을 넣고 불활성 alumina 1g을 넣었다. 위에서 만들어진 용액을 small glass chromatographycolumn (ID :5mm, length : 15cm)에 흘려주었다. Hexane-diethyl ether(1:1 v/v) 5ml을 부어 이 과정을 2회 반복하였다. Alumina를 말린 후 10ml test tube에 옮긴 후 6% formic acid와 diisoprophy ether 1ml을 첨가하였다. 실온에서 2,000 x g 로 5분간 원심분리하여 microreaction vessel에 포집하였으며, 이를 시험용액으로하여 GC로 분석하였다.

 

- Neutral volatile compounds

에스테르화 시킨 phytosterol을 첨가한 Cheddar cheese의 neutral volatile compounds를 측정하기 위하여 Bassette and Ward의 방법(53)을 사용하였으며, GC조건은 Table 2에서와 같다. 2ml을 space vial(10ml)에 취하여 Na2SO4 0.5g을 첨가한 후 teflon 마개로 밀봉하였다. 정량분석방법을 설명하면 다음과 같다. Cheese 30g과 3차증류수 30ml에 혼합하여 총 고형분이 30%가 되도록 액화시켰다. 50ml을 Kemmer-Hallet type micro-kjeldahl distillation unit에 넣고 증류시켜 5ml을 수집하였다. 이 때 사용할 시료로 물이 끓기 시작해서 2분 30초 후에 나온 것을 5ml 수집하였다. 60℃ water bath에 2분간 정치한 후 2분간 vortex mixer로 혼합하였다. 다시 60℃ water bath에 8분간 정치하고 headspace gas 1ml을 취하여 GC로 분석하였다.

 

 

- 유리 아미노산 측정 (Free amino acids)

이동상으로 A용액(TCD + Ethanol + HCl + caprylic acid / 증류수 1L)과 B용액(TCD + NaCl + NaOH + Sodium tetraborate + caprylic acid / 증류수 1L), C용액( NaOH + caprylic acid /증류수 1L)을 사용하였다. 시료의 주입량은 5㎕였으며, 이동상의 속도는 0.45ml/min, column은 shodex Cx Pak(4.6mn ×15cm)를 사용하였고, 형광검출기(Water 486 RI detector)를 사용하였으며, 표준 아미노산은 Pierce H-type (2.5μmol/ml)을 사용하였다. Cheese의 쓴맛을 내는 유리아미노산을 측정하기 위해 cheese 5g과 증류수 5ml을 혼합한 용액에 1g의 sulphosalicylic acid를 첨가 한 후 4℃에서 1시간 방치하였다. 이를 4000rpm에서 15분간 원심 분리하고 그 상징액을 0.45㎛ 여과지로 여과한 후 시료로 사용하였다. 유리아미노산 분석은 다음의 Table 3과 같이 Lindroth와 Mopper의 OPA-percolum reaction 방법(54)으로 전처리한 후 HPLC를 사용하여 분석하였다.