유청 프로바이오틱스 유산균과 다이어트의 관계성 실험

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가. 프로바이오틱스 유산균주 선발

1) 유산균수 측정

유산균수의 변화는 Richardson(1985)방법에 따라 시료 1.0mL 를 채취하여 멸균식염수에 십진 희석법으로 희석한 뒤 BCP 한천배지(Eiken chemical Co., Ltd., Shimotsuga, Japan)를 이용하여 평판배양법으로 37℃에서 24시간 배양하며 0, 6, 12, 18, 24 시간 간격으로 나타난 노란색 colony 수를 측정하여 log CFU (colony forming unit)/mL 로 나타내었다.

 

2) pH 및 산도 측정

pH 는 pH meter(iSTEK. Co. Ltd, Model pH-200L, Korea) 를 이용하여 측정하였다. 산도는 시료 10mL에 증류수 10mL 를 혼합하고 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3 이 되는 시점까지 적정하였고 이에 소비된 NaOH 용액을 다음 식에 따라 계산하였다.

 

3) 일반성분 분석

액상유청은 MILKO SCAN(MilkoscanTM Minor 78110, Foss, slangerupgade, Denmark) 분석기를 이용하였고, 분말 유청은 AOAC 법에 따라서 유당, 단백질, 지방 및 총고형분 함량을 측정하였다.

 

4) 유리아미노산 분석

유리아미노산의 정량 분석은 소요시간이 상대적으로 짧은 Water AccQ-tag 방법을 이용하여 분석하였다. HPLC(Waters e2695, WATERS Co., USA)의 분석조건은 Table 1 과 같으며, 17 종의 아미노산 표준품 aspatic acid(Asp), serine(Ser), glutamic acid(Glu), Glycine(Gly), histidin(His), arginine(Arg), threonine(Thr), alanine(Ala), proline(Pro), cysteine(Cys), tyrosine(Tyr), valine(Val), methionine(Met), lysine(Lys), isoleucine(Ile), leucine(Leu), phenylalanine(Phe)과 AccQ-Fluor reagent, Borate buffer 는 WATERS 사 제품을 사용하였다.

 

나. 유청 가수분해물의 분자량 별 분획

65℃에서 30 분간 저온 살균한 유청에 MRS broth 에서 계대배양한 유산균을 1.0% 접종하여 37℃에서 24 시간 배양한 다음 10℃에서 10,000rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 취한 뒤 한외여과 장치(Stirred cell Model 8400, Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 시료를 30k Da, 10k Da, 5k Da 및 1k Da 의 membrane filter(Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 로 분자량에 따라 분획하였다 (Fig. 1).

 

다. 유청 가수분해 분말 제조 방법

치즈제조 시 나온 유청을 63℃에서 30 분간 저온 살균한 후 균주를 접종(단일균주: 1.0%씩, 혼 합균주: 0.25%씩 총 1.0%가 되게 접종)한 후 37℃에서 24 시간 배양한 뒤 - 80℃에서 하루 동안 동결시키고 동결건조기를 이용하여 분말화하였다(Fig. 2).

 

라. 동물모델을 이용한 가수분해물 효능평가

 

1) 실험설계

실험에 사용된 동물은 생후 4 주령 된 C57BL/6 수컷 Mouse로 40마리를 샘타코(주)로부터 구입하였으며, 1 주일간 환경에 적응시키기 위해 실험식이 급여 전 고형 배합 사료로 급여하면서 1 주일간 예비 사육하였다. 실험동물 사육실의 조건은 온도 21∼25°C, 습도 50∼60%가 유지되도록 하였으며, 사육실 내 명암은 12 시간 주기 (09:00 a.m∼21:00 p.m.)로 조절하였다. 실험 식이는 샘타코(주)로부터 일반식이 (General diet)를, DBL(주)로부터 고지방식이(High fat diet)를 각각 구입하여 매일 일정량을 급여하고 다음날에 잔 여 량을 측정하였다(Table 2). 식수는 멸균하여 자유식(ad libitum)으로 공급하 였다. 실험동물은 완전임의배치법(Completely randomized design)에 의해 각 군당 10마리씩 정상 대조구 (General fat diet, GF), 고지방 대조구 (High fat diet, HF), 고지방+유청 (High fat diet+Whey, HFW)식이구 및 고지방+유청가 수분해물 (High fat diet+Whey hydrolyzates, HFWH)식이구의 4 개군으로 분류 하고 (Table 3), 각각의 실험 식이를 급여하여 4 주간 사육하였다. 실험기간 동안 식이섭취량은 1 일 1 회(10:00 am), 증체량은 1주일에 1회씩 일정한 시간(15:00 pm)에 측정하였다.

 

2) 실험식이

실험 식이는 1 일 1 회 일정한 시간에 일정량 (1개군 당 20g)으로 완전 자유 급여를 실시하였으며 다음날에 잔여 량을 측정하여 식이섭취량을 측정하였다. 유청 및 유청가수분해물은 mouse 의 체중 1 kg 당 100 mg 으로 환산하여 제공하기 직전에 멸균 증류수에 현탁하여 1일 1회 일정한 시간(10:00am)에 oral zonde 를 이용하여 경구 투여 하였다.

 

3) 시료수집

실험동물을 희생시키기 전에 하룻밤 동안 절식시킨 후 다음날 저녁에 디에틸에테르(DAEJUNG Chemical, Korea)를 사용하여 마취시킨 뒤 혈액과 조직의 시료를 수집하였다. 혈액은 심장천자 (Fig. 3)하여 실온에서 1∼2 시간 방치 후 3,000 rpm 에서 20 분간 원심분리하고 혈청을 얻어 분석 전까지 - 70°C 에서 냉동 보관하였다. 혈액을 채취한 후 즉시 개복하여 주요 장기인간, 신장, 고환 및 비장을 적출 (Fig. 3)하였고 체지방 량을 측정하기 위해 신장과 부고환 주변의 지방조직을 적출하여 각각 멸균 생리식염수 (0.85% NaCl)에 세척하여 여과지에 물기를 제거한 후 무게를 측정하였다.

 

4) 혈청의 생화학적 분석

냉동 보관된 혈청은 Intoto(주)에 의뢰하여 혈중 지질, 혈당 및 아디포카인을 분석하였다. 가) 혈액 성분 분석 혈액의 당 농도, 총 콜레스테롤 (Total cholesterol), 고밀도 지단백 콜레스테롤 (HDL-cholesterol), 저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-cholesterol) 및 중 성지방 (Triglyceride)을 ADVIA 1650 chemistry (Siemens, Tarrytown, NY, USA) 를 이용하여 분석하였다. 혈당농도 측정은 실험동물의 12시간 절식 후에 실시하였다. 나) 아디포카인 분석 아디포카인 중 아디포넥틴 (Adiponectin), 레지스틴 (Resistin) 및 RBP4(Retinol binding protein 4)를 분석하였다. 마우스 혈청 내 아디포넥틴(Inter- assay CV: 5.24%. Intra-assay CV: 2.63%), RBP4 (Inter assay CV: 5.30%. Intra assay CV: 3.58%) 및 레지스틴 (Inter assay CV: 7.10%. Intra assay CV: 3.79%)은 모두 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 측정하였다 (AdipoGen, Seoul, Korea).

 

5) 통계처리

모든 실험결과는 SAS program (SAS 9.2 version)을 이용하여 평균과 표준편차 (mean ± SD)로 제시하였다. 각 처리 별 유의성 검증은 ANOVA test 후 Duncan's multiple range test 로 <0.05 수준에서 검정하였다.